Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8710-1:2011

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-1:2011

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 1: BỆNH CÒI DO VI RÚT Ở TÔM

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 1: Penaeus monodon type baculovirus disease

Lời nói đầu

TCVN 8710-1:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

TCVN 8710-1:2011

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 1: BỆNH CÒI DO VI RÚT Ở TÔM

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 1: Penaeus monodon type baculovirus disease

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn, sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh còi do vi rút Penaeus Monodon type baculovirus(MBV) gây ra ở tôm.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

Bệnh còi do vi rút trên tôm (monodon type baculovirus disease)

Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút thuộc giống Baculovirus. Vi rút có dạng hình que, có axit nuleic là ADN mạch đôi, thuộc nhóm có thể ẩn.

CHÚ THÍCH: Hiện nay đã có hai chủng vi rút được nghiên cứu và mô tả: MBV từ tôm Penaeus monodon vùng Thái Bình Dương,có cấu trúc chính (nucleocapsid): (42 nm ± 3 nm) x (246 nm ± 15 nm) và vi thể vi rút (virion) có kích thước (75 nm ± 4 nm) x (324 nm ± 33 nm). Một chủng khác được phân lập trên tôm Penaeus plebejus, P. monodon, P. merguiensis ở Úc cũng có cấu trúc tương tự MBV ở Ấn Độ, Thái Bình Dương có cấu trúc chính (nuleocapsid): (45 nm đến 52 nm) x (260 nm đến 300 nm) và vi thể vi rút (virion) có kích thước 60 nm x 420 nm.

3. Phương pháp chẩn đoán

3.1 Chẩn đoán lâm sàng

3.1.1 Dịch tễ học

Đặc điểm phân bố: MBV đã trở thành bệnh dịch động vật thủy sản trên các loài tôm thuộc họPeenaeidae.

Bệnh lây lan thông qua các cá thể bị nhiễm bệnh trong ao, bể do tôm ăn thức ăn có chứa mầm bệnh, do dụng cụ đựng thức ăn bị nhiễm hoặc qua vật chủ trung gian như copepoda, tôm, cua, ghẹ… hoặc các loài chim mang mầm bệnh MBV vào vùng nuôi.

Giai đoạn cảm nhiễm: tất cả các giai đoạn ngoại trừ trứng và ấu trùng Naupli, tỉ lệ cảm nhiễm từ 1 % trên tôm tự nhiên, có thể lên đến 100 % trong các trại sản xuất giống.

3.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn ấu trùng biến thái (zoea, mysis) và giai đoạn đầu của tôm giống (postlarvae) bị cảm nhiễmMBV nặng có thể quan sát thấy ruột giữa có màu sắc nhợt nhạt, do sự xuất hiện của các thể ẩn và các mảnh vụn tế bào trong phân.

Tôm giống nhiễm nặng thường yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, sinh trưởng chậm, chuyển giai đoạn không đều, tỉ lệ chết tích luỹ có thể lên đến 90 % nếu môi trường không ổn định.

Tôm thương phẩm thường phân đàn, có thể sau 3 tháng đến 4 tháng nuôi vẫn có kích thước rất nhỏ gọi là “tôm kim”.

Cơ quan kí sinh: tế bào biểu bì của cơ quan gan tụy và ruột giữa.

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

3.2.1 Phương pháp PCR

3.2.1.1 Nguyên tắc

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham ra của mồi, bốn loại gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các chu kì luân nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại ADN đích gồm 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch, tổng hợp mạch ADN mới.

Phương pháp PCR tổ (nested PCR): là PCR có hai giai đoạn, giai đoạn đầu dùng cặp mồi ngoài (gọi là PCR vòng ngoài) để khuếch đại một đoạn ADN đích. Sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài này làm

khuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong (gọi là PCR vòng trong) để khuếch đại đoạn ADN trong đoạn ADN đích.

3.2.1.2 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương đương không có ARNase, trừ khi có quy định khác.

– Dung dịch đệm TE (Tris – EDTA)

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng axitclohydric (HCl) để chỉnh pH 7,6.

– Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 mL nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 mL. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng

– Pha dung dịch TBE 1 X

Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris – axit boric – EDTA 10X)

Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 mL nước. Thêm 40 mL EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch 1X.

– Dung dịch đệm tải mẫu ADN đậm đặc 6 lần (loading dye 6X)

Chuẩn bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM (sử dụng dung dịch EDTA 0,5 M). Bảo quản ở nhiệt độ -20 oC.

– Cồn 95 %

– Bộ Kít tách chiết ADN

– Thang chuẩn ADN (ADN marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp.

– Etidi bromua (EtBr)

– Agaroza.

3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh. Yêu cầu cơ bản là phòng thử nghiệm cần có các khu vực riêng biệt để thao tác tách chiết ADN, tiến hành phản ứng PCR và điện di đọc kết quả.

– Tủ lạnh;

– Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ -20 ºC;

– Máy li tâm, có thể hoạt động với vận tốc 13000 r/min.

– Tủ ấm, có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 oC.

– Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, , có thể hoạt động ở nhiệt độ 95 ºC;

– Máy lắc trộn vortex;

– Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg;

– Đèn cồn;

– Khay hay hộp đựng đá lạnh;

– Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 2 µl đến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl;

– Giá cho ống eppendof có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;

– Bộ kéo panh vô trùng, chày nghiền mẫu, bút đánh dấu, sổ ghi chép;

– Hộp đựng giấy thấm, găng tay, khẩu trang;

– Hộp đựng đầu típ micropipet các loại;

– Máy luân nhiệt (máy PCR);

– Bếp điện hoặc lò vi sóng;

– Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;

– Bình nón bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 250 ml;

– Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;

– Buồng đổ gel;

– Bàn đọc gel (UV);

– Giấy parafin.

3.2.1.4 Lấy mẫu

Tôm bố mẹ: lấy mẫu phân tôm bố mẹ.

Tôm giống (lớn hơn postlavare 8, hay hậu ấu trùng lớn hơn 8 ngày tuổi): lấy một phần khối gan tụy, lấy khoảng 10 con đến 15 con.

Tôm nhỏ hơn tôm giống (nhỏ hơn postlavare 8): lấy phần đầu khoảng 10 con đến 15 con. Ấu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng 50 con.

Lượng mẫu lấy để tách chiết ADN khoảng 20 mg, có thể dùng tôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong cồn 95 % để tách chiết ADN.

3.2.1.5 Cách tiến hành

3.2.1.5.1 Tách chiết ADN

CHÚ THÍCH: Hiện nay có rất nhiều thuốc thử và bộ kít thương mại tiện lợi cho việc tách chiết ADN (QiaGen, Promega…). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ví dụ quy trình tách chiết ADN bằng dung dịch đệm chiết tách (Lysis Buffer) (kít IQ2000MBV): Cho mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml.

Nếu mẫu cố định trong cồn 95 %, cần làm khô cồn bằng cách: đổ cồn và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.

Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl dung dịch tách chiết, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 300 µl đến 400 µl dung dịch tách chiết và nghiền tiếpđến khi nhuyễn.

Ủ mẫu ở nhiệt độ 95 oC trong 10 min, ly tâm 12000 r/min trong thời gian 10 min.

Chuyển 200 µl phần dịch nổi sang ống Eppendorf mới có chứa 400 µl cồn 95 %, trộn trên máy lắc trộn vortex hoặc lắc nhẹ.

Ly tâm 12000 r/min trong thời gian 5 min, sau đó loại bỏ cồn và làm khô mẫu.

Hòa tan ADN bằng nước tinh khiết hoặc dung dịch đệm TE 1X với lượng khoảng từ 50 µl đến 200 µl tùy thuộc vào lượng ADN tách chiết được.

CẢNH BÁO AN TOÀN: Tách chiết axít nucleic phụ thuộc vào việc phân giải hay hoà tan của các mô và sự phân tách của axít nucleic từ hỗn hợp kết cấu phức tạp. Hầu như các quy trình đều sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

3.2.1.5.2 Tiến hành phản ứng PCR

3.2.1.5.2.1 Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo phương pháp PCR tổ (nested PCR)  khuếch đại ADN đặc hiệu của vi rút MBV, sử dụng cặp mồi MBV1.4 F/R và MBV1.4 NF/NR (Bảng 1).

Bảng 1 – Ví dụ về cặp mồi

Mồi	Trình tự nucleotit
MBV 1.4F	5′-CGA- TTC-CAT-ATC-GGC-CGA-ATA-3′
MBV 1.4R	5′-TTG-GCA-TGC-ACT-CCC-TGA-GAT-3′
MBV 1.4NF	5′-TCC-AAT-CGC-GTC-TGC-GAT-ACT-3′
MBV 1.4NR	5′-CGC-TAA-TGG-GGC-ACA-AGT-CTC-3′

Cặp mồi MBV 1.4 F/R dùng để khuếch đại đoạn ADN của vi rút MBV có kích thước 533 bp. Cặp mồi MBV 1.4NF /NR dùng để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 361 bp, nằm trong đoạn ADN sản phẩm bước 1 của vi rút MBV.

Chuẩn bị mồi:

– Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µL làm gốc.

– Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µL: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

3.2.1.5.2.2 Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theohướng dẫn của nhà sản xuất.

Hỗn hợp phản ứng bước 1 và bước 2 được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm. Sau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng dương và chứng âm.

3.2.1.5.2.3 Tiến hành phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1).

Thêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứngPCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5 mM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

Có thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); 400 µM dATP; 400 µM dGTP; 400 µM dTTP; 400 µM dCTP; 3 mM MgCl2; Taq ADN polymerase, và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).

Hỗn hợp phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1), sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mixcủa Promega, 2X như trong Bảng 2.

Bảng 2 – Hỗn hợp phản ứng PCR vòng ngoài

Thành phần	Thể tích cho 1 mẫu, µl	Nồng độ cuối cùng
Promega Gotag Green Master Mix, 2X	12,5	1 X
MBV1.4F mồi	0,3125 (20 µM)	0,25 µM
MBV1.4R mồi	0,3125 (20 µM)	0,25 µM
ADN mạch khuôn	2,5
Nước	9,375

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 1 được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 – Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 1

Bước	Nhiệt độ/thời gian	Số chu kỳ
	96 oC/5 min	1
Biến tính	94 oC/30 s	40
Bắt cặp	65 oC/30 s
Kéo dài mạch	72 oC/60 s
Kéo dài mạch	72 oC/7 min	1
	4 oC	Giữ ổn định

3.2.1.5.2.4 Tiến hành phản ứng PCR vòng trong (bước 2)

Thêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (sản phẩm bước 1) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: KCl 50 mM; Tris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5 mM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và nước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.

Có thể sử dụng thành phần hoá chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên, sử dụng cặp mồi MBV1.4NF và MBV1.4NR.

Hỗn hợp phản ứng PCR bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 4.

Bảng 4 – Hỗn hợp phản ứng PCR bước 2

Thành phần	25 µl/ phản ứng	Nồng độ cuối cùng
Promega Gotag Green Master Mix, 2X	12,5	1 X
MBV1.4NF mồi	0,3125 (20 µM)	0,25 µM
MBV1.4NR mồi	0,3125 (20 µM)	0,25 µM
ADN sản phẩm bước 1	2,5
Nước	9,375

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt. Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR

bước 2 được nêu trong Bảng 5.

Bảng 5 – Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 2

Bước	Nhiệt độ/thời gian	Số chu kỳ
	96 ºC/5 min	1
Biến tính	94 ºC/30 s
Bắt cặp	60 ºC/30 s	35
Kéo dài mạch	72 ºC/60 s
Kéo dài mạch	72 ºC/7 min	1
	4 ºC	Giữ ổn định

CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

3.2.1.5.3 Chạy điện di

3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC thì cho vào 5 µl etidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn. Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm. 

Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.1.5.3.2 Điện di

Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo AND marker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang ADN vào một giếng trên bản gel.

Điện di ở hiệu điện thế 100 volt đến 150 volt (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel.

3.2.1.5.4 Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.

Bảng 6 – Kết quả điện di

Giếng	Vạch 533 bp	Vạch 361 bp	Kết quả
Thang ADN	Phân vạch rõ ràng và sáng theo kích thước sử dụng Điện di tốt		Điện di tốt
Mẫu kiểm chứng dương tính	Có	Có	Hỗn hợp phản ứng PCR tốt
	Không	Có	Đạt yêu cầu
	Không	Không	Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng, enzym hỏng
	Có	Không	Không đạt yêu cầu
Mẫu kiểm chứng âm tính	Không	Không	Không ngoại nhiễm
	Có	Có	Bị ngoại nhiễm
	Có	Không
	Không	Có
Mẫu	Có	Có	Dương tính MBV
	Không	Có	Dương tính với MBV
	Không	Không	Âm tính với MBV
	Có	Không	Không chấp nhận kết quả. Phân tích lại mẫu

 Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 533 bp bước 1 và 361 bp bước 2 hoặc chỉ có vạch 361 bp. Thang ADN phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.

 Kết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch sáng kích thước 361 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính. Thang ADN phân vạch rõ ràng.

3.2.2 Phương pháp mô học

3.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử

– Dung dịch Davidson (xem A.1).

– Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

– Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

– Dung dịch xanh malachit (MG) 0,5 % (xem A.4).

– Xylen.

– Cồn 70 %, 90 % và cồn tuyệt đối.

– Parafin.

– Keo dán, ví dụ Bom Canada.

3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

– Kính giải phẫu

– Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen

– Lọ nhỏ cố định mẫu

– Bình rót parafin

– Bộ phận làm lạnh mẫu

– Máy cắt mẫu microtome

– Nồi nước có chỉnh nhiệt độ

– Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu

– Kính hiển vi quang học

– Cassete

– Khung đúc mẫu.

3.2.2.3 Lấy mẫu

Thu những mẫu tôm có biểu hiện bệnh có dấu hiệu không bình thường, tôm còi, cơ thể yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, sinh trưởng chậm, chuyển giai đoạn chậm không đều. Không dùng tôm chết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.

3.2.2.4 Cách tiến hành

3.2.2.4.1 Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm mô tươi

Mẫu tôm tiến hành từ hậu ấu trùng 5 ngày tuổi (postlarvae 5) đến hậu ấu trùng trưởng thành.

3.2.2.4.1.1 Mẫu mô gan tụy

Số tôm thu để nhuộm tươi đối với tôm ấu trùng và tôm giống là từ 30 con đến 50 con, đối với tôm nuôi là từ 5 con đến 10 con.

Đặt tôm lên lam kính, nhỏ một giọt nước muối sinh lý vừa đủ không làm mẫu khô. Dùng kính giải phẫuquan sát để lấy gan tụy của tôm.

Dùng hai kim giải phẫu nhọn, kim bên trái giữ phần mắt và anten, kim bên phải đặt lên đốt bụng thứ nhất. Từ từ tách phần bụng ra khỏi phần ngực, gan tụy lộ ra ngoài dính với phần bụng. Tách lấy phần gan tụy.

Nhỏ giọt xanh malachit (MG) 0,5 % lên khối gan tụy, dùng lamen ép mỏng quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100X, 400X.

Đọc kết quả:

Tế bào bình thường: nhân và tế bào chất bắt màu MG đậm hơn.

Tế bào mang mầm bệnh MBV: tế bào gan tụy phình to, trong nhân có từ một đến nhiều thể ẩn hình cầu  có kích thước khoảng 0,1 µm đến 20 µm. Các thể ẩn không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn, sáng  rõ hơn.

3.2.2.4.1.2 Mẫu phân

CHÚ THÍCH: Ưu điểm của phương pháp là có thể kiểm tra cả đối với tôm giống, tôm có kích thước lớn, tôm bố mẹ mà khônggây chết tôm, vẫn có thể loại bỏ được những đàn tôm mang mầm bệnh MBV.

Mẫu phân thu trong hồ bể nuôi, sau khi dải phân lắng xuống đáy hồ.

Mẫu phân thu đặt trên lam, nhỏ giọt MG 0,5 %, ép lamen và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Nếu tôm nhiễm bệnh sẽ quan sát thấy các thể ẩn hình cầu có tính khúc xạ nên sáng rõ hơn các thể hình cầu khác thấy trong phân.

Đánh giá cường độ cảm nhiễm MBV theo 3 mức:

Mức thấp (+): tổng số nhân tế bào gan tuỵ bị nhiễm MBV nhỏ hơn 30 %.

Mức trung bình (++): tổng số nhân tế bào gan tuỵ bị nhiễm MBV từ 30 % đến 60 %. Mức cao (+++): tổng số nhân tế bào gan tuỵ bị nhiễm MBV lớn hơn 60 %.

Tỉ lệ cảm nhiễm là số tôm nhiễm bệnh trên tổng số tôm kiểm tra

3.2.2.4.2 Chẩn đoán bằng phương pháp cắt mô

3.2.2.4.2.1 Chuẩn bị mẫu

Cố định mẫu trong dung dịch Dadvison. Đối với ấu trùng hoặc tôm hậu ấu trùng có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa gan tụy), dùng dung dịch Davidson tiêm vào gan tuỵ và vùng xung quanh gan tuỵ. Lượng thuốc dùng từ 0,1 ml đến 10 ml (thay đổi tuỳ kích thước tôm), sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2.2 Khử mẫu cố định

Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.2.3 Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min. 
Ngâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

3.2.2.4.2.4 Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.2.5 Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòinước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

3.2.2.4.2.6 Đọc kết quả

Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao (100 X; 400 X, 1000 X).

Khi tôm bị bệnh MBV cho thấy một số thể ẩn hình cầu, bắt màu hồng của eosin, nằm trong nhân tế bào biểu mô gan tuỵ phình to. Ở những đàn tôm bị nhiễm nặng, trong mỗi nhân tế bào phình to có chứa hàng chục thể ẩn và có một tỷ lệ lớn những nhân tế bào có chứa thể vùi. Đây chính là căn cứ để đánh giá mức độ nhiễm nặng hay nhẹ ở một mẫu tôm nghiên cứu.

4. Kết luận

Tôm được xác định nhiễm bệnh MBV khi có kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau:

– Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính.

– Mẫu mô nhuộm tươi và mẫu cắt mô xuất hiện thể ẩn của MBV.

 

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch Davidson

Cồn 95 %:                                                       330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %):                        220 ml

Axit axetic đậm đặc:                                       115 ml

Nước:                                                             335 ml

A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin – Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể:                             1 g

Natri iodat:                                                       0,2 g

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g

Axit xitric:                                                        1 g

Cloral hydrat:                                                  50 g

Nước:                                                             1000 ml

Hoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit xitric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3 Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y:                                                           1 g

Cồn 70 %:                                                       1 lít

Axit axetic băng:                                             5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn 70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4 Dung dịch xanh malachit 0,5 %

Xanh malachit (MG):                                      5 g

Nước:                                                             100 ml

Hoà tan MG trong nước, sau đó lọc qua giấy lọc. 

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Belcher C.R. & Young P.R. 1998. Colourimetric PCR-based detection of Monodon baculovirus in whole Penaeus monodon postlarvae. J. Virol. Methods, 74, p. 21-29.

[2] Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thuỷ sản.

[3] Doubrovsky A., P.J.L., Sambhi S.K., Atherton J.G. & Lester R.J.G. 1988. Observations on the ultrastructure of baculovirus in Australian Penaeus monodon and Penaeus merguiensis. Aust. J. Mar. Freshwater Res. 39: p. 743 – 749.

[4] Lightner, D.V., Redman, R.M., Bell, T.A., Observations on the geographic distribution, pathogenesis and morphology of the baculovirus from Penaeus monodon fabricius. Aquaculture, 1983. 32: p. 209- 233.

[5] Lightner DV (ed). A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. World Aquaculture Soc., Baton Roug. 1996.

[6] Lester R.J.G., D.A., Paynter J.L., Sambhi S.K. & Atherton J.G, Light and electron microscope evidence of baculovirus infection in the prawn Penaeus plebejus. Dis. Aquat. Org, 1987. 3: p. 217 – 219.

[7] Leobert D. de la Pena , C.R.L.P., Corina Belle R. Villar, Milagros G. Paner Geimbo C. Capulos, Prevalence of monodon baculovirus (MBV) in wild shrimp Penaeus monodon in the Philippines. Aquaculture 2008. 285 p. 19-22.

[8] Oanh, D.T.H., Phuong, N.T., Presto, N., Hodgson, R.,Walker, P., , Prevalence of White Spot Syndrome virus (WSSV) and Monodon baculovirus (MBV infection in Penaeus monodonpostlarvae in Vietnam. Walker, P., Lester, R., Bondad Reantaso, M.G., 2005. Diseases in Asian Aquaculture V. Fish Health Section: p. 395-404.

[9] OIE, Manual of diagnostic tests for Aquatic animals 2006.