Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN10413-1:2014

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10413-1:2014

ISO 9167-1:1992

HẠT CẢI DẦU – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSINOLAT – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Rapeseed – Determination of glucosinolates content – Part 1: Method using high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 10413-1:2014 hoàn toàn tương đương với ISO 9167-1:1992, sửa đổi 2013;

TCVN 10413-1:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

HẠT CẢI DẦU – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSINOLAT – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Rapeseed – Determination of glucosinolates content – Part 1: Method using high-performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng các glucosinolat khác nhau trong hạt cải dầu sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

CHÚ THÍCH

1. Phương pháp này không xác định các glucosinolat được thay thế phân tử glucose, tuy nhiên các hợp chất này không quan trọng trong hạt cải dầu thương mại.

2. Phưong pháp xác định nhanh hàm lượng các glucosinolat sử dụng quang phổ huỳnh quang tia X quy định trong ISO 9167-2

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

ISO 664:19901), Oilseeds – Reduction of laboratory sample to test sample (Hạt có dầu – Phương pháp lấy mẫu thử từ mẫu phòng thử nghiệm)

ISO 665:19772), Oilseeds – Determination of moisture and volatile matter content (Hạt có dầu – Xác định độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi)

3. Nguyên tắc

Chiết glucosinolat bằng methanol, sau đó tinh sạch và khử sulfat bằng enzym trên resin trao đổi ion. Phép xác định sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo với rửa giải gradient và detector UV.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng phân tích và nước phải phù hợp với loại 2 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác.

4.1. Metanol, loại dùng cho HPLC, dung dịch 70 % (thể tích).

4.2. Natri axetat, 0,02 mol/l ở pH 4,0.

4.3. Natri axetat, dung dịch 0,2 mol/l.

4.4. lmidazol format, dung dịch 6 mol/l.

Hòa tan 204 g imidazol trong 113 ml axit formic đựng trong bình định mức một vạch 500 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch.

4.5. Chất chuẩn nội, sử dụng sinigrin ngậm một phân tử nước (kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước M_r = 415,49) (xem 4.5.1) hoặc glucotropaeolin (benzylglucosinolat, muối kali, M_r = 447,52) (xem 4.5.2) đối với hạt cải dầu (được trồng hoặc mọc hoang) chứa sinigrin tự nhiên.

Đối với hạt cải dầu có hàm lượng glucosinolat thấp (< 20=””>mm/g), giảm nồng độ chất chuẩn nội (từ 1 mmol/l đến 3 mmol/l) trong 4.5.1 và 4.5.2.1.

4.5.1. Sinigrin ngậm một phân tử nước

4.5.1.1. Sinigrin ngậm một phân tử nước, dung dịch 5 mol/l

Hòa tan trong nước 207,7 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc trong thời gian dài hơn nếu bảo quản trong tủ lạnh đông ở -18 °C.

4.5.1.2. Sinigrin ngậm một phân tử nước, dung dịch 20 mmol/l.

Hòa tan trong nước 831,0 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch.

Dung dịch này có thể bảo quản một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc trong thời gian dài hơn nếu bảo quản trong tủ lạnh đông ở -18°C.

4.5.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng một hoặc một số trong 3 phép thử dưới đây:

– phân tích HPLC sử dụng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này;

– phân tích sinigrin bằng HPLC (kỹ thuật ghép cặp ion);

– phân tích sinigrin đã silyl hóa và khử sulfat bằng sắc ký khí.

Đối với mỗi phép thử, sắc ký đồ chỉ có một pic chính chiếm ít nhất 98 % tổng diện tích pic.

Xác nhận độ tinh khiết bằng cách định lượng glucose tách ra sau khi thủy phân bằng myrosinase (thioglucoside glucohydrolase, EC 3.2.3.1). Đo glucose bằng phương pháp enzym. Sử dụng các bộ thử có bán sẵn trên thị trường thì thuận tiện hơn cho việc xác định. Đưa vào tính toán bất kỳ glucose tự do hiện có; chất này được xác định theo cách tương tự nhưng không bổ sung myrosinase. Nồng độ phân tử của glucose tách ra đạt ít nhất bằng 98 % nồng độ phân tử của dung dịch sinigrin đã kiểm tra.

4.5.2. Glucotropaeolin

CHÚ THÍCH 3 Glucotropaeolin thường khó phân tách ra khỏi các glucosinolate tự nhiên khác.

4.5.2.1. Glucotropaeolin, dung dịch 5 mmol/l.

Hòa tan trong nước 233,8 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch.

4.5.2.2. Glucotropaeolin, dung dịch 20 mmol/l.

Hòa tan trong nước 895,0 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch.

4.5.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết theo quy trình quy định trong 4.5.1.3.

4.5.2.4. Hệ số đáp ứng

Xác nhận các hệ số đáp ứng của glucotropaeolin, so sánh với sinigrin tương ứng với các hệ số đáp ứng được đưa ra trong 9.2.

4.6. Pha động

4.6.1. Dung môi A: nước, được tinh lọc qua hệ thống cột than hoạt tính (ví dụ: hệ thống Norganic Millipore1)) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

4.6.2. Dung môi B: axetonotril, loại dùng cho HPLC, dung dịch 20% (thể tích) trong nước đã tinh sạch. Nồng độ có thể thay đổi tương ứng với các cột được sử dụng.

4.7. Resin trao đổi ion, sử dụng 4.7.1 hoặc 4.7.2.

4.7.1. Huyền phù DEAE Sepharose CL-6B2) có bán sẵn trên thị trường để sử dụng hoặc sản phẩm tương đương.

4.7.2. Huyền phù DEAE Sephadex A25²⁾, được chuẩn bị như sau:

Trộn 10 g resin DEAE Sephadex A25 (hoặc resin tương đương) trong dung dịch axit axetic 2 mol/l dư.

Để cho lắng xuống. Thêm axit axetic 2 mol/l cho đến khi thể tích của dịch lỏng bằng hai lần thể tích của phần lắng.

4.8 Sulfatase, loại Helix pomati typ H1 (EC 3.1.6.1), có hoạt độ lớn hơn 0,5 đơn vị hoạt độ trên mililit dung dịch sulfatase đã tinh lọc.

Tinh lọc, kiểm tra và pha loãng sulfatase theo phương pháp quy định trong 4.8.1 đến 4.8.4.

4.8.1. Chuẩn bị cột trao đổi ion

Cắt 7 cm phía trên cổ của năm pipet Pasteur (5.9) và đặt nút bông thủy tinh (5.8) vào cổ. Đặt pipet thẳng đứng trên giá và thêm từng lượng vừa đủ resin trao đổi ion (4.7), khi nước chảy hết thi thu lấy 500 ml thể tích resin.

Rót 1 ml dung dịch imidazole format (4.4) vào từng pipet và rửa hai lần, mỗi lần 1 ml nước.

4.8.2. Tinh sạch

Cân 25 mg Helix pomatia typ H1 (4.8), chính xác đến 0,1 mg, hòa tan trong 2,5 ml nước và chuyển 500 ml dung dịch này vào từng cột đã chuẩn bị trong 4.8.1. Rửa từng cột với 1,5 ml nước và loại bỏ dịch rửa giải. Sau đó thêm 1,5 ml dung dịch natri axetat (4.3) và thu dịch rửa giải từ năm cột vào ống nghiệm.

Cô đặc dịch rửa giải bằng cách lọc, sử dụng màng lọc Millipore PTGC 11K253) cho đến khi thu được khoảng 100 ml dịch lỏng (không cho sulfatase có khối lượng phân tử cao hơn 5 000 đi qua). Thêm 2,5 ml nước và cô đặc thêm một lần nữa bằng cách lọc cho đến khi thu được khoảng 100 ml dịch lỏng. Pha loãng đến 2,5 ml với nước và bảo quản sulfatase đã tinh sạch trong tủ lạnh đông ở – 18 °C với một lượng nhỏ cho phép rã đông một lượng cần thiết để sử dụng ngay.

4.8.3. Kiểm tra hoạt độ sulfatase

4.8.3.1. Chuẩn bị dung dịch sinigrin 0,15 mmol/l, được bổ sung đệm đến pH 5,8.

Chuẩn bị ba dung dịch liên tiếp như sau:

a) chuyển 1 ml axit axetic vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và thêm nước đến vạch;

b) chuyển 1 ml etylen diamin vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và thêm nước đến vạch;

c) trộn 73 ml dung dịch a) với 40 ml dung dịch b) và sử dụng dung dịch a) hoặc dung dịch b) để chỉnh hỗn hợp đến pH 5,8 là thích hợp.

Rót 3 ml dung dịch sinigrin 5 mmol/l (4.5.1.1) vào bình định mức một vạch 100 ml và thêm dung dịch c) đến vạch.

4.8.3.2. Kiểm tra hoạt độ

Dùng pipet chuyển 2 ml dung dịch sinigrin đã bổ sung đệm (4.8.3.1) vào cuvet đo và cuvet so sánh của máy đo phổ (5.3) được chỉnh đến bước sóng 229 nm với nhiệt độ cuvet là 30 °C. Ở thời gian t = 0, thêm 50 ml sulfatase đã tinh sạch (4.8.2) vào cuvet đo và bật máy ghi ngay. Dừng máy ghi khi không có sự chênh lệch độ hấp thụ (A_e), dựng đường tiếp tuyến tới điểm t = 0 và đo gradient DA/Dt.

Hoạt độ của sulfatase (nghĩa là: sản phẩm của 1 mmol sinigrin desulfat trên 1 min ở 30 °C và pH 5,8), được biểu thị bằng đơn vị hoạt độ trên mililit dung dịch sulfatase, bằng công thức:

Trong đó:

DA/Dt là gradient của đường tiếp tuyến tới điểm t = 0, tính bằng đơn vị độ hấp thụ trên phút;

V là thể tích môi trường phản ứng (nghĩa là 2,05 x 10^-3 l), tính bằng lít (I);

De (khoảng 1 500 l.mol^-1.cm^-1) là chênh lệch giữa hệ số tắt phân tử của sinigrin và desulfosinigrin ở 228 nm, nghĩa là:

Trong đó

A_e là chênh lệch giữa độ hấp thụ của sinigrin khử sulfat ở điểm cân bằng và độ hấp thụ tại thời điểm t = 0;

I là chiều dài đường quang của cuvet, tính bảng centimet (nghĩa là: 1 cm);

c là nồng độ của sinigrin đã khử sulfat ở điểm cân bằng, tính bằng mol trên lit, nghĩa là:

mol/l

0,95 là hiệu suất ở điểm cân bằng của sinigrin khử sulfat.

Ngoài ra, hoạt độ của sulfatase có thể được tính theo công thức sau:

4.8.4. Pha loãng

Dùng pipet chuyển 1 ml sulfatase đã tinh sạch (4.8.2) vào bình định mức một vạch dung tích 10 ml. Thêm nước đến vạch và trộn.

Chia dung dịch thành các lượng nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm, và cụ thể như sau:

5.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao, thích hợp để thu được garient rửa giải và kiểm soát nhiệt độ cột ở 30 °C, nối với detedor UV cho phép đo ở bước sóng 229 nm.

5.2. Cột sắc ký dùng cho HPLC, loại C₁₈ hoặc C₈ có cỡ hạt nhỏ hơn hoặc bằng 5 mm, ví dụ4):

Cột Lichrosorb RP 18, £ 5 mm (150 mm x 4,6 mm)

Cột Spherisorb ODS2, £ 5 mm (250 mm x 4 mm; 250 mm x 5 mm)

Cột Novapak C18, 4 mm (150 mm x 4 mm)

Cột Lichrospher RP8, £ 5 mm (125 mm x 4 mm)

Cột Nucleosil C18, £ 5 mm (200 mm x 4 mm)

Hiệu năng của cột phải được kiểm tra thường xuyên, tốt nhất là sử dụng mẫu so sánh của desulfoglucosinolat từ dầu hạt cải5). Đặc biệt, cột không được làm suy giảm 4-hydroxyglucobrassicin, một glucosinolat quan trọng nhưng tương đối không ổn định.

Các cột mới phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất để ổn định cột sao cho thu được các kết quả tái lập.

5.3. Máy đo phổ hai chùm tia, có khả năng hoạt động trong vùng tia UV của quang phổ và ở nhiệt độ được kiểm soát là 30 °C, được trang bị các cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 1 cm và một hệ thống ghi.

5.4. Máy nghiền tinh, ví dụ: cối xay cafê.

5.5. Máy ly tâm, thích hợp để sử dụng với các ống nghiệm (5.6), có thể đạt được gia tốc hướng tâm là 5 000 g.

5.6. Ống nghiệm polypropylen, dung tích 6 ml.

5.7. Nồi cách thủy hoặc thiết bị gia nhiệt khác, có thể duy trì nhiệt độ ở 75 °C ± 1 °C.

5.8. Bông thủy tinh.

5.9. Pipet Pasteur, chiều dài 150 mm có giá đỡ thích hợp hoặc vài dụng cụ thích hợp khác.

6. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu có thể được tiến hành theo TCVN 8946 (ISO 542)^[3].

Nếu phần lớn các tạp chất không chứa dầu đã được loại ra trước khi giảm mẫu phòng thử nghiệm, thì cho phép đưa vào trong tính toán.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Giảm mẫu phòng thử nghiệm theo ISO 664.

Nếu các hạt có hàm lượng ẩm và hàm lượng chất bay hơi vượt quá 10 % (khối lượng), thì cần sấy khô, sử dụng dòng khí ở khoảng 45 °C.

Mức tạp chất thường là 2 % (khối lượng). Nếu có sinigrin trong mẫu thử thì thực hiện phép thử trên hạt tinh khiết và phân tích tạp chất được tách ra.

Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng chất bay hơi của mẫu thử theo TCVN 8949 (ISO 665).

Nếu các hạt đã được xử lý, rửa chúng với dichlorometan.

Nghiền các hạt bằng máy nghiền tinh (5.4) trong 20 s. Trộn và sau đó nghiền thêm 5 s.

8. Cách tiến hành

8.1. Phần mẫu thử

Ghi nhãn hai ống nghiệm A và B (5.6) và chuyển 200 mg của mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 7) vào từng ống nghiệm, cân chính xác đến 0,1 mg.

8.2. Chiết glucosinolat

8.2.1. Đặt ống nghiệm trong nồi cách thủy hoặc thiết bị gia nhiệt khác ở 75 °C và trong 1 min. Thêm 2 ml dung dịch metanol đun sôi (4.1) và sau đó thêm ngay:

– vào ống nghiệm A 200 ml dung dịch chuẩn nội 5 mmol/l (4.5.1.1), và

– vào ống nghiệm B 200 ml dung dịch chuẩn nội 20 mmol/l (4.5.1.2)

8.2.2. Tiếp tục gia nhiệt ở 75 °C thêm 10 min, lắc ống nghiệm sau mỗi khoảng thời gian nhất định. Trộn các lượng chứa trong mỗi ống nghiệm và sau đó ly tâm ở gia tốc hướng tâm 5 000 g trong 3 min. Chuyển phần dịch lỏng phía trên trong mỗi ống nghiệm vào hai ống nghiệm khác (5.6) được ghi nhãn A’ và B’.

8.2.3. Thêm 2 ml dung dịch metanol đang sôi (4.1) vào hai ống nghiệm chứa chất rắn còn lại và gia nhiệt lại 10 min trong nồi cách thủy hoặc thiết bị gia nhiệt khác (5.7) ở 75 °C, lắc ống nghiệm sau mỗi khoảng thời gian nhất định.

Ly tâm 3 min và sau đó chuyển phần dịch lỏng phía trên từ hai ống nghiệm vào phần dịch lỏng bề mặt tương ứng thu được trong 8.2.2.

8.2.4. Điều chỉnh thể tích của các chất chiết hỗn hợp đến khoảng 5 ml bằng nước và trộn.

Các dịch chiết này có thể giữ được 2 tuần nếu bảo quản ở nơi tối trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

8.3. Chuẩn bị cột trao đổi ion

Cắt một số pipet Pasteur (5.9) theo yêu cầu, ví dụ một pipet chứa một dịch chiết hỗn hợp sao cho có được thể tích 1,2 ml lên cổ từng pipet và nút bông thủy tinh (5.8) trên từng cổ của pipet. Đặt pipet thẳng đứng trên giá.

Chuyển 0,5 ml huyền phù đã trộn kỹ của resin trao đổi ion (4.7) vào từng pipet và để lắng.

Rửa pipet với 2 ml imidazole format (4.4) và sau đó rửa 2 lần, mỗi lần dùng 1 ml nước.

8.4. Tinh sạch và khử sulfat

8.4.1. Thực hiện các thao tác nêu ra trong 8.4.2 đến 8.4.5 đối với từng dịch chiết hỗn hợp.

8.4.2. Chuyển 1 ml dịch chiết (8.2.4) vào cột đã chuẩn bị (8.3) không làm đảo trộn bề mặt resin và để ráo. Thêm hai lần, mỗi lần 1 ml đệm natri axetat (4.2), để cho đệm ráo sau mỗi lần thêm.

8.4.3. Thêm 75 ml dung dịch sulfata đã tinh sạch và đã pha loãng (4.8.4) vào cột. Để qua đêm ở nhiệt độ môi trường.

8.4.4. Đặt ống nghiệm (5.7) dưới cột để thu dịch rửa giải.

Rửa giải desulfoglucosinolat thu được hai lần, mỗi lần 1 ml nước, để nước ráo sau mỗi lần thêm.

8.4.5. Trộn kỹ dịch rửa giải. Nếu không phân tích sắc ký ngay, thì dịch rửa giải có thể bảo quản được một tuần ở nơi tối trong tủ lạnh đông ở – 18 °C.

8.5. Phép thử trắng

Nếu cần (xem 9.3), thực hiện phép thử trắng sử dụng cùng quy trình trên phần mẫu thử được lấy từ cùng một mẫu thử, nhưng không dùng dung dịch chuẩn nội sinigrin để phát hiện và định lượng sự có mặt của sinigrin trong phần mẫu thử.

8.6. Chạy sắc ký

8.6.1. Điều chỉnh thiết bị

Điểu chỉnh điều kiện sắc ký của máy để đưa ra:

– Tốc độ dòng của pha động (4.6), phụ thuộc vào bản chất của cột (xem 8.6.2), thường là 1 ml/min.

– Nhiệt độ cột (5.2) là 30 °C, và

– bước sóng phát hiện 229 nm.

8.6.2. Phân tích

Vận hành theo hướng dẫn sử dụng thiết bị, bơm vào máy sắc ký không quá 50 ml dung dịch desulfoglucosinolat thu được trong 8.4.4.

Sử dụng rửa giải gradient thích hợp với cột được sử dụng.

CHÚ THÍCH

4. Các rửa giải gradient sau đây được đưa ra làm ví dụ:

a) Cột Lichrosorb RP 18, £ 5 mm (150 mm x 4,6 mm)

– cho 100 % dung môi A (4.6.1) qua trong 1 min

– áp dụng rửa giải gradient tuyến tính đến 20 min cho đến khi thu được 0 % dung môi A và 100 % dung môi B (4.6.2)

– áp dụng rửa giải gradient tuyến tính đến 5 min cho đến khi thu được 100 % dung môi A và 0 % dung môi B

– cho 100 % dung môi A qua trong 5 min để đạt được sự cân bằng

b) Cột Lichrosorb RP 8, £ 5 mm (125 mm x 4 mm)

– cho 100 % dung môi A qua 2 min 30 s

– áp dụng rửa giải gradient tuyến tính trong 18 min cho đến khi thu được 0 % dung môi A và 100 % dung môi B

– cho 100 % dung môi B qua 5 min

– áp dụng rửa giải gradient tuyến tính qua 2 min cho đến khi thu được 100 % dung môi A và 0 % dung môi B

– cho 100 % dung môi A qua trong 5 min để đạt được sự cân bằng

5. Các chế độ gradient có thể được điều chỉnh để phân tách tối ưu theo các cột được sử dụng.

8.6.3. Kiểm tra sắc ký

Chỉ đưa vào tính toán các pic có diện tích lớn hơn 1 % tổng diện tích các pic.

Thứ tự rửa giải của các pic với cột loại C₁₈ và rửa giải gradient thích hợp (xem các ví dụ nêu trong 8.6.2) thể hiện trong Hình 1.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Tính hàm lượng của từng glucosinolat

Hàm lượng của từng glucosinolat, biểu thị bằng micromol trên gam chất khô của sản phẩm, theo công thức:

Trong đó:

A_g là diện tích pic của với desufoglucosinolat, tính bằng đơn vị tích phân;

A_s là diện tích pic tương ứng với chất chuẩn nội đã sử dụng, tính bằng đơn vị tích phân;

K_g là hệ số đáp ứng của desulfoglucosinolat (9.2);

K_s là hệ số đáp ứng của chất chuẩn nội sử dụng;

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

n là khối lượng chất chuẩn nội được thêm vào ống nghiệm trong 8.2, tính bằng micromol (mm);

w là hàm lượng độ ẩm và chất bay hơi của mẫu thử, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.

Nếu cần biểu thị kết quả theo độ ẩm và hàm lượng chất dễ bay hơi w_s, [ví dụ: w_s = 9% (khối lượng)], thì nhân kết quả thu được theo chất khô (như trên) với

9.2. Hệ số đáp ứng

Các hệ số đáp ứng sau được chấp nhận.

CHÚ THÍCH 6 Hệ số đáp ứng này đã được xác định bằng thực nghiệm và được thống nhất bằng sự thỏa thuận giữa các phòng thử nghiệm khác nhau đã tham gia thử nghiệm, các hệ số này có thể cần được sửa đổi vào thời điểm thích hợp.

1	Desulfoglucoiberin	1,07
2	Desulfoprogoitrin	1,09
3	Desulfoepi-progoitrin	1,09
4	Desulfosinigrin	1,00
5	Desulfoglucoraphanin	1,07
6	Desulfogluconapoleiferin	1,00
7	Desulfoglucoalyssin	1,07
8	Desulfogluconapin	1,11
9	Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin	0,28
10	Desulfoglucobrassicanapin	1,15
11	Desulfoglucotropaeolin	0,95
12	Desulfoglucobrassicin	0,29
13	Desulfogluconasturtin	0,95
14	Desulfo-4-methoxyglucobrassicin	0,25
15	Desulfoglucobrassicin	0,20
16	Các desulfoglucosinolate khác	1,00

9.3. Tính hàm lượng glucosinolat tổng số

Hàm lượng glucosinolat tổng số, được biểu thị bằng micromol trên gam chất khô của sản phẩm, bằng tổng hàm lượng của từng glucosinolat (diện tích các pic tương ứng lớn hơn 1 % tổng diện tích các pic).

Nếu chênh lệch giữa kết quả của hàm lượng glucosinolat tổng số sử dụng cả hai nồng độ đáp ứng theo các yêu cầu đối với độ lặp lại (xem 10.2), thì chất chuẩn nội không bị nhiễm bẩn. Trong trường hợp này lấy kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định.

10. Độ chụm

10.1. Các kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm

Phép thử liên phòng thử nghiệm, thực hiện ở cấp quốc tế năm 1988, với 11 phòng thử nghiệm tham gia, thực hiện hai phép xác định trên từng mẫu, cho các kết quả thống kê (đánh giá theo ISO 5725) thể hiện trong Bảng 1

Bảng 1 – Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Mẫu	Hạt cải dầu A	Hạt cải dầu B	Hạt cải dầu C	Hạt cải dầu D
Số phòng thử nghiệm giữ lại sau khi đã trừ ngoại lệ	11	11	11	11
Hàm lượng glucosinolat trung bình (mmol/g chất khô)	20,6	14,1	4,9	25,6
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr	1,7	0,6	0,3	0,8
Hệ số biến thiên lặp lại	8,5%	4,4 %	6,7 %	3,3 %
Độ lặp lại, 2,83 sr	4,9	1,7	0,9	2,4
Độ lệch chuẩn tái lập, sR	3,4	2,5	1,5	2,4
Hệ số biến thiên tái lập	17%	18%	31 %	9,4%
Độ tái lập, 2,83 sR	9,6	7,1	1,4	6,8

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không lớn hơn 2 mmol/g đối với hàm lượng glucosinolat ít hơn 20 mmol/g và 4 mmol/g đối với hàm lượng glucosinolat trong dải từ 20 mmol/g đến 35 mmol/g.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không lớn hơn 4 mmol/g đối với hàm lượng glucosinolat ít hơn 20 mmol/g và 8 mmol/g đối với hàm lượng glucosinolat trong dải từ 20 mmol/g đến 35 mmol/g.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ phương pháp thử đã sử dụng và các kết quả thu được, cùng với tất cả các hoạt động được đề cập đến không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Báo cáo kết quả phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

Hình 1 – Ví dụ về sắc ký đồ điển hình

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 8946:2011 (ISO 542:1990) Hạt có dầu – Lấy mẫu

[2] ISO 5725:1986, Precision of test methods – Detemnination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests

---