Tiêu chuẩn ngành 28TCN200:2004

TIÊU CHUẨN NGÀNH

28 TCN 200 : 2004

VIBRIO CHOLERAE TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH

Vibrio cholerae in fishery products – Method for qualitative analysis

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định tính vi khuẩn Vibrio cholerae trong sản phẩm thuỷ sản.

2. Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo chương 9, Sổ tay phân tích vi sinh, tái bản lần 8 năm 1998 của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ.

3. Nguyên tắc

Vibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae là phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng di động, phản ứng oxidaza dương tính, phát triển được ở nhiệt độ 42⁰C, lên men đường sacaroza, khử lysin; phát triển được ở môi trường không có muối nhưng không phát triển được ở môi trường có nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat.

Phát hiện Vibrio cholerae bằng cách tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc và cấy chuyển phân lập trên môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.

4. Thiết bị, dụng cụ và môi trường, thuốc thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Tủ ấm (37,0⁰C ± 1,0⁰C).

4.1.2 Bể điều nhiệt (42,0⁰C ± 0,2⁰C).

4.1.3 Cân có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.4 Máy nghiền đồng thể.

4.1.5 Máy lắc ống nghiệm.

4.1.6 Đĩa petri.

4.1.7 Ống nghiệm đường kính các cỡ: 13, 16 và 18 mm.

4.1.8 Một số thiết bị thông thường khác như: máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh.

4.2 Môi trường, thuốc thử

4.2.1 Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW)

 Pepton : 10,00 g

 Natri clorua (NaCl) : 10,00 g

 Nước cất : 1,00 lít pH = 8,5 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi.

4.2.2 Môi trường phân lập: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacaroza (TCBS thạch)

Pepton : 10,00 g

 Cao nấm men : 5,00 g

 Natri xitrat : 10,00 g

 Natri thiosunphat (Na₂S₂O₃) : 10,00 g

 Mật bò : 5,00 g

 Sacaroza : 20,00 g

 Natri clorua (NaCl) : 10,00 g

 Sắt (III) xitrat (FeC₆H₅O₇) : 1,00 g

 Natri cholate : 3,00 g

 Xanh bromthymol : 0,04 g

 Xanh thymol : 0,04 g

 Thạch  : 15,00 g.

Nước cất vô trùng : 1,00 lít pH = 8,6 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C).

Đun sôi để hoà tan hoàn toàn các thành phần rồi làm nguội ngay tới nhiệt độ khoảng 50⁰C. Rót 15 – 20 ml vào các đĩa petri vô trùng. Trước khi sử dụng phải làm khô đĩa môi trường bằng cách để qua đêm ở nhiệt độ trong phòng hoặc đặt đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 37⁰C – 45⁰C.

Chú thích: không hấp khử trùng môi trường

4.2.3 Môi trường, thuốc thử sinh hoá

4.2.3.1 Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar -TSI

Pepton : 15,00 g

Proteose pepton : 5,00 g

Cao thịt bò : 3,00 g

Cao nấm men : 3,00 g

Natri clorua (NaCl) : 5,00 g

Lactoza : 10,00 g

Sacaroza : 10,00 g

Glucoza : 1,00 g

Sắt (II) sunphat (FeSO₄) : 0,20 g

Natri thiosunphat (Na₂S₂O₃) : 0,30 g

Đỏ phenol : 0,024 g

Thạch  : 12,00 g

Nước cất : 1,00 lít pH = 7,4 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 – 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 – 5 cm.

4.2.3.2 Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar -KIA

Polypepton pepton : 20,00 g

Natri clorua (NaCl) : 5,00 g

Lactoza : 20,00 g

Dextroza : 1,00 g

Sắt ammoni xitrat : 0,50 g

Natri thiosulphat (Na₂S₂O₃) : 0,50 g

Phenon đỏ : 0,025 g

Thạch : 15,00 g

Nước cất : 1,00 lit pH = 7,4 ± 0.2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Cách pha như qui định tại Điều 4.2.3.1

4.2.3.3 Hugh – Leifson Glucoza

Pepton : 2,00 g

Cao nấm men : 0,50 g

Natri clorua (NaCl) : 30,00 g

Dextroza : 10,00 g

Tím bromcresol : 0,015 g

Thạch : 3,00 g

Nước cất : 1 ,00 lít pH = 7,4 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Đun nóng để hoà tan hoàn toàn các thành phần trên rồi chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút.

4.2.3.4 O/F Glucoza

 Trypton : 2,00 g

 Natri clorua (NaCl) : 5,00 g

 Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄) : 0,30 g

 Xanh bromthymol : 0,03 g

 Thạch  : 2,00 g

 Glucoza : 10,00 g

 Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

 Đun sôi để hoà tan các thành phần rồi rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút .

4.2.3.5 Canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T₁N₀; T₁N₁; T₁N₃; T₁N₆; T₁N₈ và T₁N₁₀)

Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đó, thêm lần lượt : 10, 30, 60, 80 và 100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl như trên. Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C). Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút.

Chú thích: các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối.

4.2.3.6 Môi trường thử decarboxylaza (Môi trường cơ bản)

Pepton : 5,00 g

Cao nấm men : 3,00 g

Glucoza : 1,00 g

Tím bromcresol : 0,02 g

Nước cất : 1,00 lít pH = 6,5 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g một trong các loại axitamin: L-lysin hoặc L-arginin hoặc L-ornithin vào môi trường cơ bản trên. Sau đó, rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 10 phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy.

4.2.3.7 Canh thang urê

urê : 20,00 g

Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄) : 9,50 g

Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄) : 9,10 g

Cao nấm men : 0,10 g

Đỏ phenol : 0,01 g

Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 ± 0,1 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Hoà tan các thành phần. Không được hấp khử trùng, lọc vô trùng bằng màng lọc có đường kính lỗ là 0,45 l. Sau đó, rót khoảng 1,5 – 3,0 ml vào các ống nghiệm hoặc đĩa petri đã được sấy vô trùng.

4.2.3.8 Canh thang bromcresol ( Môi trường cơ bản)

 Pepton : 10,00 g

 Natri clorua (NaCl) : 5,00 g

 Cao thịt bò : 3,00 g

 Tím bromcresol : 0,04 g

 Nước cất : 1,00 lít pH = 7,0 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH sao cho môi trường sau khi pha đạt yêu cầu như trên rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 10 phút.

Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton và D-mannoza) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 ± 0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản. Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%.

4.2.3.9 Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl

 Trypton : 10,00 g

 Natri clorua (NaCl) : 20,00 g

 Thạch  : 20,00 g

 Nước cất : 1,00 lít pH = 7,2 ± 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)

Đun sôi để hoà tan các thành phần trên. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút. Sau đó, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 – 50⁰C rồi rót ra đĩa hoặc ống nghiệm.

4.2.3.10 Thuốc thử Oxidaza

Hoà tan 1,0 g N,N, N^‘, N^‘-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng. Đựng dung dịch trong lọ sẫm màu hoặc bọc lọ trong giấy bạc. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 – 8⁰C, sử dụng trong vòng 7 ngày.

4.2.3.11 Dầu khoáng vô trùng

Rót khoảng 20 – 50 ml dầu khoáng vào bình có nắp xoáy. Hấp dầu ở nhiệt độ 121 ⁰C trong 30 phút.

4.2.3.12 Thuốc thử ONPG

Dung dịch đệm:

Natri dihydro phosphat ngậm 1 phân tử nước (NaH₂PO₄.H₂O) : 6,90 g

Nước cất  : 45,00 ml

Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v)  : 3,00 ml

Hoà tan NaH₂PO₄.H₂O trong nước cất. Thêm dung dịch NaOH 30% và chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 25⁰C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 – 8⁰C.

Dung dịch ONPG:

ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg

Nước cất ở 37⁰C : 15,00 ml

Dung dịch đệm : 5,00 ml

Hoà tan ONPG trong nước cất ở nhiệt độ 37⁰C. Thêm dung dịch đệm vào rồi lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8⁰C. Trước khi sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 37⁰C.

Chú thích: có thể sử dụng đĩa ONPG được sản xuất sẵn thay cho dung dịch ONPG.

4.2.3.13 Các đĩa 10 g và 150 g O/129 Vibriostat

Cắt giấy lọc thành các mảnh tròn đường kính khoảng 5 – 6 mm rồi đặt vào các đĩa petri, hấp khử trùng.

Chuẩn bị đĩa 150 g O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 – diamino – 6,7 – diisopropyl – pteridin photphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 15,0 mg/ml, nhỏ 10l dung dịch này vào mỗi đĩa.

Chuẩn bị đĩa 10 g O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 – diamino – 6,7 – diisopropyl – pteridine phosphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1,0mg/ml, nhỏ 10l dung dịch này vào mỗi đĩa.

Sấy khô các đĩa, bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng.

4.2.3.14 Dung dịch nước muối sinh lý

Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút rồi để nguội.

5. Phương pháp tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu

5.1.1 Chuẩn bị mẫu thuỷ sản

Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW (4.2.1) vào túi, nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2 phút.

5.1.2 Chuẩn bị mẫu hàu

Lấy phần thịt của 10 – 12 con hàu (kể cả nước) rồi cắt nhỏ, trộn đều. Sau đó, nghiền bằng máy nghiền đồng thể 50 g mẫu hàu trong 450 ml nước pepton kiềm APW (4.2.1) trong 2 phút. Chia dung dịch mẫu này vào 2 bình vô trùng, mỗi bình chứa 250 ml rồi pha loãng thành hai dãy bằng cách trộn đều 10 ml dung dịch mẫu trong 90 ml nước pepton kiềm APW (4.2.1). Ủ mẫu ở hai chế độ nhiệt là 37,0⁰C ± 1,0⁰C và 42,0⁰C ± 0,2⁰C theo như qui định tại Điều 5.2.

5.2 Tăng sinh

5.2.1 Đối với mẫu thông thường

Ủ các bình chứa mẫu đã chuẩn bị tại Điều 5.1.1 (kể cả mẫu chứng dương và mẫu chứng âm) ở nhiệt độ 37,0⁰C ± 1,0⁰C trong 6 – 8 giờ. Sau đó, phân lập như qui định tại Điều 5.3, phần còn lại ủ tiếp 16 – 24 giờ rồi phân lập lại.

5.2.2 Đối với mẫu hàu

Ủ 1 dãy pha loãng 10^-1 đến 10^-2 ở nhiệt độ 37,0⁰C ± 1,0⁰C trong 6 – 8 giờ và 16 – 24 giờ.

Ủ 1 dãy pha loãng 10^-1 đến 10^-2 ở nhiệt độ 42,0⁰C ± 0,2⁰C trong 6 – 8 giờ.

5.3 Phân lập và đọc kết quả trên đĩa

Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trên (5.2), không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch (4.2.2). Ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 37,0⁰C ± 1,0⁰C trong 18 – 24 giờ.

Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V. cholerae tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh.

5.4 Thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh

5.4.1 Thử nghiệm sinh hoá sơ bộ

Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl (4.2.3.9). Ủ ở nhiệt độ 37,0⁰C ± 1,0^oC trong 18 – 24 giờ. Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh hoá.

5.4.1.1 Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA

Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) vào các ống thạch nghiêng TSI (4.2.3.1) hoặc KIA (4.2.3.2). Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0⁰C ± 1,0⁰C trong 18 – 24 giờ.

Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H₂S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H₂S.

5.4.1.2 Thử nghiệm với các canh thang trypton muối

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % (4.2.3.5). Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0 ± 1,0 ⁰C trong 18 – 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 – 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường.

5.4.1.3 Thử nghiệm lên men – oxy hoá

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza (4.2.3.3) hoặc O/F glucoza (4.2.3.4). Phủ khoảng 1 – 2 ml dầu khoáng vô trùng (4.2.3.11) vào một trong 2 ống. Ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37,0 ± 1,0⁰C trong 1 – 2 ngày. V. cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh – Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng.

5.4.1.4 Thử nghiệm oxidaza

Đặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 – 3 giọt thuốc thử oxidaza (4.2.3.10). Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây .

Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này.

5.4.1.5 Nhuộm gram

V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.

5.4.2 Thử nghiệm sinh hoá khẳng định

5.4.2.1 Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 42⁰C

Cấy vi khuẩn từ TSA (5.4.1) vào một ống canh thang trypton 1% NaCl (4.2.3.5). Ủ ở nhiệt độ 42,0⁰C ± 0,2⁰C trong 18 – 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42⁰C làm môi trường bị đục.

5.4.2.2 Thử nghiệm cacbonhydrat

Cấy vi khuẩn từ TSA (5.4.1) vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D-mannoza (4.2.3.8). Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37,0⁰C ± 1,0⁰C. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.

V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza, cellobioza, arabinoza âm tính.

5.4.2.3 Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza

Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA (5.4.1) vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin (4.2.3.6) và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 – 2 ml dầu khoáng vô trùng (4.2.3.11). Ủ các ống ở nhiệt độ 37,0⁰C ± 1,0 ⁰C trong 18 – 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).