Nội dung toàn văn Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11292:2016 về Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng taurine – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 11292:2016
THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TAURINE – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO
Animal feeding stuffs – Determination of taurine content – Reverse-phase higt performance liquid chromatographic method
Lời nói đầu
TCVN 11292:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 999:12 Taurine in pet food;
TCVN 11292:2016 do viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TAURINE – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO
Animal feeding stuffs – Determination of taurine content – Reverse-phase higt performance liquid chromatographic method
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo để xác định hàm lượng taurine trong thức ăn chăn nuôi.
CHÚ THÍCH: Đối với thức ăn dạng khô hoặc dạng ướt dành cho chó và mèo, khoảng định lượng của phương pháp là từ 150 mg/kg đến 2 000 mg/kg. Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 9498), Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.
3 Nguyên tắc
Phần mẫu thử được thủy phân bằng axit clohydric, taurine đã chiết được cho phần ứng với dansyl clorua để tạo dẫn xuất phát huỳnh quang, dẫn xuất này được xác định bằng HPLC pha đảo.
4 Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.
4.1 Axit clohydric loãng, 6 M
Thêm từ từ 500 ml axit clohydric (HCI) đặc (nồng độ từ 36,5 đến 38,0%) vào 500 ml nước.
4.2 Dung dịch natri cacbonat, 0,2 M, pH 9,7
Hòa tan 21,2 g natri cacbonat (Na2CO3) trong 800 ml nước. Chỉnh pH đến 9,7 bằng dung dịch axit clohydric 6 M (4.1), sử dụng máy đo pH và pha loãng đến 1 000 ml. Dung dịch này bền được 6 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ phòng.
4.3 Axetonitril (C2H3N), loại dùng cho HPLC.
4.4 Dung dịch axetonitril-nước, 70 : 30 (phần thể tích)
4.5 Axeton (C3H6O), tối thiểu 99,5 %.
4.6 Dung dịch dansyl clorua (C12H12ClNO2S)
4.6.1 Dung dịch chuẩn gốc, 100 mg/ml
Hòa tan 1,000 g dansyl clorua (tối thiểu 95 %) bằng axeton (4.5) đựng trong bình định mức 10 ml và thêm axeton đến vạch. Khi được bảo quản ở nơi tối, dung dịch này có thể bền được một tháng.
4.6.2 Dung dịch chuẩn làm việc
Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn gốc (4.6.1) đến 10 ml bằng dung dịch axetonitril-nước (4.4). Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng.
4.7 Dung dịch axit orthophosphoric (H3PO4), 2 % thể tích
Pha loãng 2,35 ml axit phosphoric 85 % bằng nước đến 100 ml.
4.8 Dung dịch đệm phosphat, 0,5 M, pH 6,2
Hòa tan 30,6 g kali dihydrophosphat (KH2PO4) và 4,36 g dikali hydrophosphat (K2HPO4) trong khoảng 400 ml nước và chỉnh pH đến 6,2 bằng axit phosphoric (H3PO4). Thêm nước đến 500 ml.
4.9 Dung dịch chuẩn taurine (C2H7NO3S)
4.9.1 Dung dịch chuẩn gốc, 1 mg/ml
Hòa tan 100,0 mg taurine (tối thiểu 99 %) trong nước và pha loãng đến 100 ml. Khi được bảo quản ở 4 0C dung dịch này có thể bền được một tuần.
4.9.2 Dung dịch chuẩn làm việc
Pha loãng các lượng dung dịch chuẩn gốc (4.9.1) với nước để chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc có chứa 0 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 80 µg/ml vá 100 µg/ml. Khi được bảo quản ở 4 °C các dung dịch này có thể bền được một tuần.
4.10 Pha động
4.10.1 Dung môi A, dung dịch đệm phosphat 0,02 M, pH 3,0
Hòa tan 2,72 g kali dihydrophosphat trong khoảng 800 ml nước và chỉnh pH đến 3,0 bằng axit phosphoric. Thêm nước đến 1 000 ml. Lọc qua bộ lọc màng (5.5).
4.10.2 Dung môi B
Trộn 600 ml axetonitril với 400 ml pha động A (4.10.1).
5 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
5.2 Máy sắc ký lỏng, có hệ thống rửa giải gradient, bộ lấy mẫu tự động với vòng bơm mẫu 20 µl.
5.3 Detector huỳnh quang, với bước sóng kích thích 298 nm và bước sóng phát xạ 550 nm.
5.4 Cột HPLC, cột pha đảo, C8 hoặc C18, hạt nhồi silica cỡ 4 µm hoặc 5 µm.
5.5 Bộ lọc, dùng một lần, dạng xyranh có đầu lọc bằng polyvinyliden florua (PVDF), cỡ 0,2 µm, ví dụ: Gelman Acrodisc hoặc loại tương đương.
5.6 Máy trộn vortex.
5.7 Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 100 ml, 500 ml và 1 000 ml.
5.8 Tủ sấy, có thể duy trì ở 110 °C.
5.9 Tủ sấy hoặc bộ gia nhiệt, có thể duy trì ở 65 °C.
5.10 Pipet.
5.11 Chai đựng thuốc thử, có nút vặn dung tích 25 ml.
5.12 Lọ đựng mẫu (vial), dung tích 2 ml.
5.13 Xyranh, có thể phân phối thể tích 2 ml.
6 Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu.
7 Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).
Nếu mẫu thử dạng khô thì nghiền lượng mẫu thử thích hợp thành dạng bột mịn. Đồng nhất mẫu thử đã nghiền bằng máy đồng hóa.
8 Cách tiến hành
8.1 Tách và tạo dẫn xuất
8.1.1 Thủy phân
Cân 400 mg mẫu khô đã nghiền hoặc 800 mg mẫu ướt đã trộn kỹ, chính xác đến 0,1 mg cho vào chai đựng thuốc thử có nút vặn dung tích 25 ml (5.11). Thêm 10 ml axit clohydric 6 M (4.1). Vặn nút chai và thủy phân hỗn hợp 16 h trong tủ sấy 110 °C (5.8). Làm nguội đến nhiệt độ phòng, chuyển định lượng phần đã thủy phân sang bình định mức 25 ml (5.7) và thêm nước đến vạch. Lọc khoảng 2 ml dịch thủy phân đã pha loãng bằng bộ lọc 0,2mm dạng xyranh (5.5). Dùng pipet (5.10) chuyển 250 µm dịch thủy phân đã lọc sang lọ phản ứng 2 ml (5.12) và cho bay hơi đến khô dưới dòng nitơ. Giữ ở nhiệt độ nhỏ hơn 70 °C để tránh thất thoát taurine.
8.1.2 Tạo dẫn xuất
Hòa tan phần cặn còn lại thu được ở 8.1.1 trong 100 µl nước và trộn trên máy trộn vortex (5.6). Thêm 0,5 ml dung dịch natri cacbonat (4.2) và trộn trong 10 s. Thêm 0,5 ml dung dịch chuẩn làm việc dansyl clorua (4.6.2) và trộn trong 10 s. Đậy nút lọ và đặt trong tủ sấy hoặc bộ gia nhiệt duy trì ở 65 °C (5.9) trong 30 min. Làm nguội đến nhiệt độ phòng và thêm 100 µl dung dịch axit phosphoric 2 % (4.7) và trộn trong 10 s. Thêm 0,5 ml dung dịch đệm phosphat 0,5 M (4.8) và 0,3 ml nước, trộn trong 10 s. Các bước trộn đều thực hiện trên máy trộn vortex (5.6).
Dùng xyranh 2 ml (5.13) chuyển hỗn hợp phản ứng qua bộ lọc 0,2 µm dạng xyranh (5.5) vào lọ lấy mẫu tự động HPLC (dung dịch có thể bền đến 2 ngày khi bảo quản ở -20 °C cho đến khi phân tích).
Xử lý 100 µl của từng dung dịch chuẩn làm việc (4.9.2) tương tự như trên.
8.2 Xác định bằng HPLC
Cài đặt thiết bị với tốc độ dòng 1,5 ml/min, chương trình gradient, tỉ lệ dung môi A (4.10.1) và B (4.10.2) theo Bảng 1. Tối ưu hóa các điều kiện tách để thu được pic của taurine tốt nhất.
Để ổn định HPLC, bơm lặp lại nhiều lần các thể tích 20 µl dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử đã tạo dẫn xuất, sử dụng chương trình gradient trong Bảng 1, các giá trị trong bảng có thể thay đổi để phù hợp với các đặc tính của cột phân tích.
Bảng 1 – Chương trình gradient
|
Thời gian, min |
Phần trăm |
|
|
Dung môi A |
Dung môi B |
|
|
0 |
80 |
20 |
|
21 |
71 |
29 |
|
25 |
20 |
80 |
|
40 |
20 |
80 |
|
42 |
80 |
20 |
|
47 |
80 |
20 |
Bơm các thể tích 20 µl dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử đã tạo dẫn xuất và dựng đường chuẩn theo diện tích hoặc chiều cao của pic, sử dụng bộ tích phân điện tử hoặc máy tính. Đường chuẩn đi qua gốc tọa độ và tuyến tính.
9 Tính kết quả
Hàm lượng taurine trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:
Trong đó:
Rtest là đáp ứng pic (chiều cao hoặc diện tích) của taurine trong dịch chiết mẫu;
S là độ dốc của đường chuẩn, tính bằng mililit trên microgam (ml/µg);
V1 là thể tích dịch chiết được hoàn nguyên, tính bằng microlit (V1 = 100 µl);
V2 là thể tích dịch chiết được lấy để tạo dẫn xuất, tính bằng microlit (V2 = 250 µl);
V3 là thể tích cuối cùng của dịch chiết mẫu, tính bằng mililit (V3 = 25 ml);
w là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) Phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) Tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) Kết quả thử nghiệm thu được.
Phụ lục A
(Tham khảo)
Độ chụm của phương pháp
Các phép phân tích kiểm tra độ chụm của phương pháp do một số phòng thử nghiệm thực hiện trên sáu mẫu, cho kết quả như sau:
|
|
Thức ăn dạng ướt cho mèo 1 |
Thức ăn dạng ướt cho mèo 2 |
Thức ăn dạng ướt cho chó |
Thức ăn dạng ướt cho chó |
Thức ăn dạng khô cho mèo 5 |
Thức ăn dạng khô cho mèo 6 |
|
Số lượng phòng thử nghiệm |
8 |
7 |
9 |
9 |
7 |
8 |
|
Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ |
1 |
2 |
0 |
0 |
2 |
0 |
|
Giá trị trung bình, mg/kg |
526 |
514 |
167 |
333 |
936 |
2256 |
|
Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối, RSDr, % |
4,1 |
3,9 |
10,0 |
7,4 |
3,2 |
5,7 |
|
Giới hạn lặp lại, r, mg/kg |
61 |
56 |
47 |
69 |
84 |
361 |
|
Độ lệch chuẩn tái lập tương đối, RSDR, % |
6,1 |
6,6 |
10,2 |
16,1 |
8,9 |
13,3 |
|
Giới hạn tái lập, R, mg/kg |
90 |
94 |
48 |
150 |
233 |
839 |
