Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-36:2015

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-36:2015

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 36: HỘI CHỨNG SUY MÒN Ở LỢN SAU CAI SỮA DO CIRCOVIRUS TYP 2

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 36: Wasting syndrome piglet weaning by circo type 2 virus

Lời nói đầu

TCVN 8400-36:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần:

– TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

– TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

– TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

– TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

– TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

– TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

– TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

– TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

– TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

– TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

– TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

– TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

– TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sẩy thai truyền nhiễm do Brucela;

– TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

– TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

– TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

– TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

– TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

– TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

– TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

– TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

– TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

– TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

– TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

– TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

– TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

– TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

– TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

– TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

– TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

– TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

– TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò;

– TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

– TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

– TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 36: HỘI CHỨNG SUY MÒN Ở LỢN SAU CAI SỮA DO CIRCOVIRUS TYP 2

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 36: Wasting syndrome piglet weaning by Circo type 2 virus

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán hội chứng suy mòn, còi cọc ở lợn sau cai sữa do circovirus typ 2 gây ra.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do circovirus typ 2 (Wasting syndrome piglet weaning by Circo type 2 virus)

Hội chứng gây ra bởi virus Circo type 2 (PCV 2), là virus thuộc giống Circovirus họ Circoviridae được phân loại là ADN virus.

CHÚ THÍCH: Hội chứng này còn được gọi là hội chứng còi cọc, giảm cân, chậm lớn, giảm sức đề kháng ở lợn con sau cai sữa.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1. Nguyên liệu cho lấy mẫu và xử lý mẫu.

3.1.1. Etanol, từ 70% (thể tích) đến etanol tuyệt đối.

3.1.2. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem A.2).

3.1.3. Dung dịch kháng khuẩn, bao gồm các loại penicillin, kanamycin, streptomycin.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho Realtime PCR

3.2.1. Kit tách chiết AND, (Cat No. 69506)

3.2.2. Kit nhân gen (Cat. 11730-017)

3.2.3. Mồi xuôi, môi ngược và mẫu dò.

3.2.5. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.5. Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.3. Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym)

Hiện nay các kit ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể PCV 2 khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT-PCR

4.1.1 Máy nghiền mẫu hoặc cối chày sứ.

4.1.2 Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

4.1.3. Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.1.4. Máy nhân gen (realtime-PCR).

4.1.5. Máy ly tâm, có thể đạt gia tốc ly tâm 900 g; 6 000 g và 20 000 g.

4.1.6. Máy lắc.

4.1.7. Máy spindown.

4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

4.2.1. Máy đọc ELISA, có thể đọc đĩa ở bước sóng 630 nm.

4.2.2. Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 °C.

5. Chẩn đoán lâm sàng

5.1. Đặc điểm dịch tễ

– Hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do PCV 2 xảy ra trên lợn thường vào khoảng 4 đến 15 tuần tuổi (phổ biến từ 6 đến 12 tuần tuổi).

– Tỷ lệ mắc bệnh tùy theo trại và theo loại lợn, biến động từ 1 % đến 60 % với tỷ lệ chết từ 50% đến 100%.

– Bệnh lây truyền qua đường hô hấp, tiêu hóa con vật hít phải không khí, ăn phải thức ăn, nước uống có nhiễm mầm bệnh PCV 2 hoặc lợn mẹ truyền bệnh cho con qua nhau thai và qua bú sữa mẹ.

5.2. Triệu chứng tâm sàng

– Hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do PCV 2 có triệu chứng đặc trưng là còi cọc, da nhợt nhạt, thở khó, đôi khi bị tiêu chảy (phân sẫm màu) và có chứng hoàng đản (triệu chứng điển hình của bệnh);

– Giai đoạn đầu bệnh các hạch lâm ba dưới da đều bị sưng to.

– Lợn sau cai sữa có hiện tượng còi cọc nên được gọi là: “Hội chứng 30 kg”.

5.3. Triệu chứng bệnh tích

– Các hạch lâm ba sưng to trong giai đoạn đầu của bệnh. Bệnh tiến triển, hạch lâm ba trở lại kích thước bình thường và thậm chí bị teo nhỏ, tuyến ức bị teo.

– Phổi sưng dai chắc như cao su. Gan bị sưng to hoặc teo nhỏ, nhạt màu, cứng, bề mặt có các hạt  nhỏ. Thận có nốt hoại tử màu trắng.

6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp Realtime PCR

6.1.1. Lấy mẫu

– Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm vi rút: lấy 5 g đến 10 g hạch lâm ba (hạch bẹn nông, amidan) của lợn nghi mắc bệnh cho vào ống 15 ml hoặc lấy 1 ml đến 2 ml máu của lợn đang sốt nghi mắc bệnh vào xylanh 5 ml.

– Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm kháng thể: lấy 0,2 ml huyết thanh của lợn nghi mắc bệnh cho vào ống 1,5 ml.

6.1.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm phải bao gói, bảo quản trong tủ lạnh có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C, vận chuyển đến phòng thí nghiệm không quá 24 h.

LƯU Ý:

+ Không lấy mẫu máu của lợn đã tiêm phòng vắc xin PCV 2 để xét nghiệm kháng thể cho mục đích chẩn đoán bệnh.

+ Tất cả các mẫu phải được dán nhãn và kèm theo các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích (nếu mổ khám).

+ Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm mẫu ngay thì mẫu xét nghiệm kháng nguyên phải được bảo quản trong tủ âm 80 °C (4.1.2) và mẫu xét nghiệm kháng thể phải được bảo quản ở tủ âm 20 °C (4.1.2).

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng (hạch, lách, phổi…): lấy từ 1 g đến 2 g, cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ (4.1.1) vô trùng với dung dịch PBS (3.1.2) để thu được huyễn dịch 1 : 10 (1 g phủ tạng + 900 ml dung dịch PBS). Cho huyễn dịch vào ống ly tâm, ly tâm (4.1.5) ở gia tốc 900 g trong 10 min, rồi thu lấy dịch nổi để xét nghiệm virus bằng phương pháp realtime PCR. Bệnh phẩm là máu lợn đang sốt: ly tâm chắt lấy huyết thanh để xét nghiệm virus bằng phương pháp realtime PCR.

6.1.4. Cách tiến hành

6.1.4.1. Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ: sử dụng quy trình tách chiết ADN (3.2.1) bằng protein K và kít tách chiết bằng cột lọc của kit Invitrogen (Cat No. 69506) (xem Phụ lục B).1)

6.1.4.2. Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.4) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của PCV 2 sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược (3.2.3). Trình tự cặp mồi được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Cặp mồi

Mồi (primers)	Trình tự (5’-3’)
Mồi xuôi (forward primer)	TGGCCCGCAGTATTCTGATT
Mồi ngược (reverse primer)	CAGCTGGGACAGCAGTTGAG
Mẫu dò (probe)	FAM-CCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATG-BHQ1

Chuẩn bị mồi như sau:

– Chuẩn bị mồi gốc: mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.7) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

– Chuẩn bị mồi sử dụng: mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM (20 ml mồi gốc được pha với 80 ml nước (3.2.5)). Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 mM (6 ml mẫu dò gốc được pha với 94 ml nước (3.2.5)). Trộn cùng 1 thể tích mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha thành hỗn hợp để tiện khi sử dụng.

6.1.4.3. Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2). Đối với kít Invitrogen (Cat. 11730-017) (3.2.2) thành phần của một phản ứng được trình bày ở Bảng 2. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml, có đầy đủ đối chứng âm và đối chứng dương.

Bảng 2 – Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần	Thể tích
Nước tinh khiết không có nuclease	6,0
Platinum SuperMix UDG	12,5
Mồi xuôi	0,5
Mồi ngược	0,5
Probe	0,5
Tổng thể tích	20

Thành phần cho một phản ứng realtime PCR (theo hướng dẫn của kít thương mại được sử dụng).

Đối chứng dương: Là mẫu ADN được tách chiết từ mẫu PCV 2 chuẩn.

Đối chứng âm: sử dụng nước tinh khiết không có nuclease (3,2,5).

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

– Cho 20 ml hỗn hợp nguyên liệu vào ống PCR 0,2 ml.

– Cho 5 ml mẫu ARN vào ống PCR.

– Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (4.1.4).

LƯU Ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu nghi ngờ, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

– Chu trình nhiệt chạy phản ứng được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit sử dụng cho phản ứng. Đối với kit Invitrogen Platinum qPCR SuperMix-UDG (Cat.11730-017) (3.2.2), chu kỳ nhiệt được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 – Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C	2 min	1 vòng
95 °C	2 min
95 °C	10 s	40 vòng
60 °C	40 s

CHÚ THÍCH: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.1.4.4. Đọc kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị C_t £ 35 (± 2 C_t), mẫu đối chứng âm không có C_t.

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị C_t £  35 được coi là dương tính,

2) Mẫu không có giá trị C_t là âm tính.

3) Mẫu có giá trị C_t £ 40 và > 35 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 để khẳng định và kết luận cuối cùng.

6.2. Phương pháp ELISA

6.2.1. Lấy mẫu

Sủ dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22 G vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở vịnh tĩnh mạch cổ lợn nghi mắc bệnh PCV 2. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản theo mục 6.1.2.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Tất cả các mẫu máu được chắt huyết thanh từ xylanh (6.2.1) sang ống nghiệm vô trùng. Thời gian kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.2.4. Cách tiến hành

Hiện nay, có nhiều bộ kít ELISA (3.4.1) phát hiện kháng thể PCV 2 bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.^[2]

CHÚ THÍCH: Phương pháp này nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể do tiêm phòng vắc xin PCV 2 hay kháng thể do nhiễm thực địa.

Ví dụ: sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PCV 2 theo quy trình của kít GreenSpring® Ab Test thì bước tiến hành được thực hiện như sau:

a) Chuẩn bị

– Nguyên liệu trong bộ kít (3.4.1) để ở nhiệt độ phòng 30 min trước khi làm phản ứng.

– Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (3.4.2).

– Pha loãng mẫu với tỷ lệ 1/40: 10 ml mẫu kiểm tra với 390 ml dung dịch pha loãng mẫu trong ống pha loãng. Sau đó 100 ml dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với bố trí mẫu tương ứng.

b) Tiến hành phản ứng ELISA

Bố trí sơ đồ đĩa ELISA phản ứng (tham khảo Phụ lục C).

1. Nhỏ 100 ml đối chứng âm chuẩn vào giếng A1 và A2;

2. Nhỏ 100 ml đối chứng dương chuẩn vào giếng B1 và B2;

3. Để trống 2 giếng C1 và C2 (Blank control well);

4. Nhỏ 100 ml huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng vào giếng D1 và D2, E1 và E2 nhỏ lần lượt cho đến hết các mẫu cần kiểm tra (mỗi mẫu làm 2 giếng);

5. Lắc đĩa nhẹ nhàng, ủ đĩa ở 37 °C (4.2.2) trong 30 min;

6. Rửa đĩa từ 3 lần đến 5 lần với lượng 300 ml cho mỗi giếng bằng nước rửa đã pha loãng;

7. Nhỏ 100 ml chất gắn kết (conjugate) vào tất cả các giếng;

8. Đậy nắp đĩa và ủ ở 37 °C (4.2.2) trong 30 min;

9. Lặp lại bước 5;

10. Nhỏ 1 giọt (khoảng 50 ml) cơ chất A và 1 giọt (khoảng 50 ml) cơ chất B vào tất cả các giếng;

11. Lắc nhẹ đĩa, đậy nắp và ủ đĩa ở 25 °C trong 10 min để tránh ánh sáng;

12. Nhỏ 50 ml dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng;

13. Đưa vào máy đọc ELISA (4.2.1) để đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 650 nm.

CHÚ THÍCH: Kết quả được đọc trong khoảng 10 min sau khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng.

6.2.5. Đọc kết quả

+ mật độ quang học (OD) của đối chứng âm £ 0,2

+ OD của đối chứng dương – OD của đối chứng âm ³ 0,2

– Đánh giá kết quả:

S/P =	(OD của mẫu – OD của đối chứng âm)
	(OD của đối chứng dương – OD của đối chứng âm)

+ Mẫu dương tính: S/P ³ 0,4

+ Mẫu âm tính: S/P < 0,4

Trong đó OD_TB650 là mật độ quang học trung bình đo ở bước sóng 650 nm.

CHÚ THÍCH : Đối với những mẫu nghi ngờ phải làm lại để khẳng định, nếu vẫn nghi ngờ thì dựa vào dịch tễ học để kết luận bệnh.

7. Kết luận

Lợn được cho là dương tính với hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do virus circo type 2 khi có các đặc điểm về triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với PCV 2 hoặc dương tính kháng thể PCV 2 bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thử

A.1. Dung dịch kháng khuẩn

A.1.1. Thành phần

Penicillin Mycostatin Streptomycin Kanamycin Nước cất

1 000 000 UI 250 000 UI 200 mg 1 000 000 UI 10 ml

A.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 mm. Bảo quản ở âm 20 °C (4.1.2).

A.2. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,2

A.2.1. Thành phần

Natri clorua (NaCl) Kali clorua (KCl) Dinatri hidrophosphat (Na2HPO4) Kali dihidrophosphat (KH2PO4) Nước cất

8 g 0,2 g 1,15 g 0,2 g 1 000 ml

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 N hoặc dung dịch axit clohydric (HCl) 1 N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp, chia nhỏ và bảo quản ở 4 ^oC (4.1.3).

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Tách chiết ADN theo quy trình của kít Invitrogen (Cat No. 69506): thực hiện như sau:

– Nhỏ 200 ml huyễn dịch bệnh phẩm (6.1.3) vào ống 1,5 ml cùng với 200 mI Lysis buffer có 25 ml proteinase K, lắc đều trên máy lắc trộn Vortex (4.1.6) trong 15 s rồi ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min;

– Ủ hỗn hợp này ở 56 °C trong 15 min;

– Ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min, thêm 250 ml etanol tuyệt đối vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn Vortex trong 15s rồi ủ 5 min;

– Ly tâm (4.1.5) ở 10 000 g trong 1 min;

– Chuyển toàn bộ hỗn hợp (675 ml) sang cột lọc có ống thu;

– Ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min. Thay cột thu mới;

– Cho 500 ml nước rửa (washing buffer) vào cột lọc. Ủ 1 min, ly tâm bằng (4.1.5) 8 000 g trong 1 min. Đổ bỏ nước trong ống thu đi;

– Cho 500 ml nước rửa (washing buffer) vào cột lọc. Ly tâm bằng (4.1.5) 13 000 g trong 1 min;

– Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ tối đa, bỏ ống thu;

– Đặt cột lọc vào ống thu ADN, nhỏ 50 ml nước không chứa men DNase vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ADN bằng cách ly tâm (4.1.5) ở 13 000 g trong 1 min, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu AND;

Bảo quản mẫu ADN thu được ở 4 °C (4.1.3) trong thời gian ngắn trước khi tiến hành chạy realtime PCR. Nếu thực hiện sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ không lớn hơn âm 20 °C (4.1.2).

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA xét nghiệm kháng thể PCV 2

Bảng C.1 – Sơ đồ đĩa ELISA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NC (-)

NC(-)

S6

S6

S14

S14

S22

S22

S30

S30

S38

S38

B

PC (+)

PC (+)

S7

S7

S15

S15

S23

S23

S31

S31

S39

S39

C

Blank

Blank

S8

S8

S16

S16

S24

S24

S32

S32

S40

S40

D

S1

S1

S9

S9

S17

S17

S25

S25

S33

S33

S41

S41

E

S2

S2

S10

S10

S18

S18

S26

S26

S34

S34

S42

S42

F

S3

S3

S11

S11

S19

S19

S27

S27

S35

S35

S43

S43

G

S4

S4

S12

S12

S20

S20

S28

S28

S36

S36

S44

S44

H

S5

S5

S13

S13

S21

S21

S29

S29

S37

S37

S45

S45

CHÚ THÍCH: PC (positive control): đối chứng dương

NC (negative control): đối chứng âm

S1 đến S45 (sample): mẫu xét nghiệm

Blank: ô để trống (không nhỏ mẫu huyết thanh kiểm tra)

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Chang et al (2010), Fast diagnosis and Quantification of Porcine Circovirus type 2 (PCV-2) using Realtime polymerase Chain reaction, J Microbiol Immunol Intect 2010; 43(2):85-92

[2] C. Chae (2004) Postweaning multisystemic wasting syndrome: a review of aetiology, diagnosis and pathology, The Veterinary Jounal 168 (2004) 41-49

[3] T. Opriessnig et al (2007), Porcine Circovirus type 2 – associated disease: Update on current terminology, clinacal manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies, J Vet Diagn Invest 19:591-615 (2007)

---