Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-8:2011

TCVN 8400-8:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 8: BỆNH NẤM PHỔI DO ASPERGILLUS Ở GIA CẦM

Animal disease – Diagnostic procedure – Part 8: Aspergillosis in poultry disease

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm (aspergillosis in poultry disease) Bệnh nấm phổi ở gia cầm do giống nấmAspergillus gây ra.

CHÚ THÍCH: Các loài nấm thường gây bệnh bao gồm A. fumigates, A. flavus, A. terreus, A. niger, A. nidulans, và A. glaucus. Trong đó A. fumigatus có vai trò gây bệnh quan trọng nhất và là nguyên nhân của 95 % số ca mắc bệnh, tiếp theo là A. flavus, các loại nấm khác ít khi phân lập được từ các trường hợp nhiễm bệnh. Bệnh nấm Aspergillus ở gia cầm không phải là bệnh truyền nhiễm mà là bệnh có tính chất cơ hội và không lây sang người. Gia cầm bị suy giảm miễn dịch do mắc các bệnh khác hoặc gặp các yếu tố gây stress rất dễ mắc bệnh. Chim cút nhật mẫn cảm nhất với nấm Aspergillus, tiếp theo là gà.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

– Môi trường thạch dextroza Sabuouraud (Sabuouraud dextrose agar), hoặc các môi trường khác để nuôi cấy nấmAspergillus (thương phẩm): thạch Czapek (Czapek’s solution agar), thạch dextroza khoai tây (Potato dextrose agar).

– Dung dịch KOH 20 %.

– Thuốc nhuộm LPCB (lactophenol cotton blue).

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:  Buồng cấy

– Nồi hấp

– Tủ ấm

– Tủ sấy

– Kính lúp

– Que cấy

– Đèn cồn

– Panh

– Kéo

– Đĩa Petri

– Lọ thủy tinh các cỡ: 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml

5. Cách tiến hành

5.1 Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Đặc điểm dịch tễ

– Gà con có tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao hơn ở gà lớn.

– Bệnh phát thành dịch ở những nơi chăn nuôi tập trung.

– Bệnh thường xảy ra khi gia cầm ăn thức ăn nhiễm nấm hoặc môi trường nuôi có nấm Aspergilus.

5.1.2 Triệu chứng

– Khó thở, thở hổn hển, gia cầm vươn cổ và há mồm ra để thở.  Chảy nhiều dịch từ mồm, mũi, mắt.

– Có thể có triệu chứng thần kinh, mất thăng bằng, trẹo cổ.  Mắt sưng.

– Giảm ăn, gầy mòn, uống nước nhiều và bài thải nước nhiều.  Gia cầm giảm đẻ.

– Ở thể cấp tính, gia cầm chết từ 1 ngày đến 2 ngày.

– Tỉ lệ chết cao ở gia cầm con (có thể lên tới trên 90 %).

5.1.3 Bệnh tích

– Gia cầm có những nốt hoặc đám màu trắng xám hay vàng ở phổi hoặc túi khí và đôi khi ở mô não hoặc túi fabricius. Với bệnh mạn tính những nốt này màu vàng nhạt rồi dần chuyển sang màu xám.

– Các túi khí dày và đục.

– Ở đường dẫn khí, phổi, túi khí hoặc ở xoang bụng có thể thấy bào tử nấm.

5.1.4 Lấy mẫu

Bệnh phẩm gồm: các tổ chức bị tổn thương, u cục ở phổi, gan, túi khí…

5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1 Kiểm tra trên kính hiển vi

Lấy tổ chức bị thương hay u cục làm tiêu bản với dung dịch KOH nồng độ 10 % đến 20 % (Phụ lục A). Sợi nấm có vách ngăn có thể thấy được trong các mô bị nhiễm.

5.2.2 Nuôi cấy và phân lập

Đặt từ 4 miếng đến 5 miếng bệnh phẩm đã được cắt nhỏ khoảng 3 mm đến 4 mm lên môi trường nuôi cấy nấm, nuôi cấy hiếu khí từ 25 0C đến 37 0C, theo dõi trong vòng 5 ngày.

Khuẩn lạc thường xuất hiện sau 2 ngày đến 3 ngày nuôi cấy.

5.2.3 Giám định hình thái nấm

Đặc điểm hình thái của nấm mốc Aspergillus từ môi trường nuôi cấy được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Một số đặc điểm hình thái của nấm mốc Aspergillus từ môi trường nuôi cấy

Loài	Khuẩn lạc	Kính hiển vi (nhuộm LPCB)
		Cuống đính Tiểu bào bào tử	Tiểu bào	Thể bình	Bào tử đính
A. fumigatus	Lúc đầu dẹt có lông tơ màu trắng, rồi nhanh chóng chuyển sang màu xanh lục ở trung tâm. Khuẩn lạc già có màu xám khói, nhưng quanh rìa vẫn màu trắng. Bề mặt khuẩn lạc có thể mềm mượt, có mào lông hoặc nếp gấp. Mặt sau của khuẩn lạc thường không màu.	Trơn, nhẵn Có hình mái không màu vòm, đường hoặc xanh kính nhạt, đường từ 20 µm kính từ 5 µm đến 30 µm. đến 8 µm, có tế bào chân điển hình ở gốc.	Có hình mái vòm, đường kính từ 20µm đến 30 µm	Có 1 lớp thể bình thứ cấp bao trùm trên 1/2 đến 2/3 tiểu bào, thể bình dài 6 µmđến 8 µm.	Hình cầu hoặc gần cầu màu xanh lá cây, có gai, xếp thành chuỗi mọc lên từ thể bình. Các chuỗi này có xu hướng cuốn vào phía trong. Đường kính từ 2 µm đến 3 µm.
A. flavus	Lúc đầu trằng, rồi chuyển sang vàng tới vàng xanh, xung quanh rìa màu trắng. Khi trưởng thành khuẩn lạc có thể có màu lục vàng. Khuẩn lạc có thể có nếp nhăn tỏa tròn hoặc dẹt. Mặt sau có màu: từ không màu đến hồng nhạt, từ nâu cho đến nâu xám.	Dài, có thành Lúc đầu dày, nhám và thon dài không màu, hơn, sau có đường kính từ hình cầu, 10 µm đến đường kính 20µm. từ 25 µm đến 65 µm.	Lúc đầu thon dài hơn, sau có hình cầu, đường kính từ 25 µm đến 65 µm	Có 1 đến 2 lớp thể bình (sơ cấp và thứ cấp) bao phủ trên toàn bộ bề mặt tiểu bào.	Hình cầu hoặc elip, có gai, màu hơi vàng nâu, đường kính từ 3 µm đến 5 µm.
A. niger	Lúc đầu có màu trắng sau có những chấm đen trên bề mặt giống như được rắc hạt tiêu. Mặt sau có màu vàng sẫm hoặc màu kem.	Dài, gầy, nhẵn, Hình cầu, trong suốt, nâu đường kính sáng, đường từ 45 µm kính từ 15 µm đến 100 µm. đến 20 µm.	Hình cầu, đường kính từ 45 µm đến 100 µm	Có 2 lớp thể bình (lớp sơ cấp ở dưới thứ cấp) trên tiểubào.	Hình cầu màu đen và nhám.

Kiểm tra hình thái sợi nấm bằng cách làm tiêu bản từ khuẩn lạc và nhuộm với thuốc nhuộm LPCB (xem Phụ lục B).

Kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm, có thể dùng kính lúp để soi.

6. Kết luận

Gia cầm được xác định là mắc bệnh nấm phổi mắc bệnh có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng và phát hiện trong phòng thí nghiệm.

 

PHỤ LỤC A

(Quy định)

CHUẨN BỊ TIÊU BẢN VỚI DUNG DỊCH KALI HYDROXYT (KOH)

A.1 Thuốc thử

Dung dịch KOH 20 %: Pha 20 g KOH bằng nước để thu được 100 ml dung dịch.

A.2 Cách tiến hành

Cho từ 1 giọt đến 2 giọt dung dịch KOH 20 % lên phiến kính.

Lấy bệnh phẩm (tổ chức tổn thương hay u cục) hòa đều vào dung dịch KOH.

Đưa nhẹ nhàng phiến kính qua ngọn lửa (không được sôi hoặc quá nóng) để làm nhanh quá trình tiêu protein.

Đặt lam kính lên mẫu, ấn nhẹ xuống.

Để từ 1 h đến 2 h hoặc để qua đêm trong hộp có khả năng giữ ẩm (cho một chút nước hay một miếng bong thấm nước vao trong hộp). Thời gian để tùy thuộc vào độ dày của mẫu, KOH sẽ làm tiêu các mảnh protein.

A.3. Xem tiêu bản

Xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học.

Quan sát được các sợi nấm, hình thái bào tử nấm đặc trưng trong các mô bị nhiễm.

 

PHỤ LỤC B

(Quy định)

CHUẨN BỊ TIÊU BẢN DÙNG THUỐC NHUỘM LACTOPHENOL COTTON BLUE

B.1 Thuốc thử

Thuốc nhuộm lactophenol cotton blue, có thành phần như sau:

Phenol tinh thể                                                  20 g

Thuốc nhuộm cotton blue                                  0,05 g

Glyxerin                                                            40 ml

Axit lactic                                                          20 ml

Nước                                                                20 ml

Hòa tan phenol tinh thể, glyxerin, axit lactic với nước trong nồi cách thủy, sau đó cho thuốc nhuộm cotton blue rồi trộn đều.

B.2 Cách tiến hành

Cho một giọt thuốc nhuộm LPCB lên phiến kính.

Lấy khoảng 2 mm đến 3 mm khuẩn lạc nấm cho vào giọt thuốc nhuộm. Đặt lam kính lên mẫu, ấn nhẹ xuống.

Đưa nhẹ nhàng phiến kính qua ngọn lửa (không được để quá nóng) để đẩy bớt bọt khí ra ngoài.

B.3 Xem tiêu bản

Xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học.